Von der hohen Kunst des Trennens

Die Chromatographie – Meilensteine in der Geschichte der analytischen Chemie

Ganz gleich, ob wir wissen wollen, woraus eine bestimmte Materie besteht, was ein Lebensmittel enthält, welche Schadstoffe sich in Wasser und Luft befinden; ob der Hausbrand ein Unglück war oder vorsätzlich gelegt wurde – in den meisten Fällen bedarf es einer chemisch-analytischen Technik, um die richtige Antwort zu finden. Ganz entscheidend ist hierbei die Chromatographie.

Trenntechniken spielen seit jeher eine entscheidende Rolle in der chemischen Analytik. Zwei der heute wichtigsten analytischen Trenntechniken sind die Gas- und Hochdruckflüssigchromatographie, Chemikern und den Anwendern auch unter den Kürzeln GC und HPLC bekannt. Diese Verfahren erlauben es, organische Substanzen aus gasförmigen, flüssigen, viskosen und festen Proben zu isolieren, auch wenn sie nur in Spuren vorliegen, einzelne Verbindungen (Moleküle) voneinander zu trennen sowie nach Art, Menge und Zusammensetzung exakt zu bestimmen. Die Chromatographie gewährt der synthetischen Chemie wichtige Einblicke in komplizierte Molekülstrukturen, und sie dient als schlagkräftiges Instrument bei der Erfassung von Schadstoffbelastungen der Umwelt.

 
 

Mikhail Semjonowitsch Tswett (1872-1919) – Die Erfindung der Adsorptionschromatographie

Der in Italien geborene Mikhail Semjonowitsch Tswett interessierte sich für die Chemie pflanzlicher Farbstoffe. Besonderes Augenmerk legte der studierte Botaniker auf das Chlorophyll, das Blattgrün, welches bei der Photosynthese eine entscheidende Rolle spielt. Wie aber ließ sich dieser Farbstoff aus seiner Matrix, dem irrelevanten pflanzlichen Blattrest, herauslösen? Nach zahllosen Experimenten fand Zswett 1903 die Lösung, indem er die Blätter mit Petroläther extrahiert und den Extrakt durch eine Glassäule fließen ließ, die er mit pulverisiertem Kalk (Calziumcarbonat) gefüllt hatte.

Was Zswett bei seinem Versuch im Labor beobachtete, schien auf den ersten Blick trivial, war jedoch aus heutiger Sicht ein Meilenstein der Chemie: die Anreicherung und Auftrennung der verschiedenen Blattfarbstoffe durch Wechselwirkungen mit einem Feststoff. Zunächst wurde eine gelblich-grüne Substanz am oberen Ende der Glassäule vom kohlensauren Kalk zurückgehalten. Goss der Wissenschaftler reines Lösungsmittel nach, verlor der Farbkranz seine Kontur; in Fließrichtung bildeten sich Zonen aus, so genannte Banden, die teils gelb, teils grün gefärbt waren. Zswett gelang es schließlich, mit Petroläther einen gelben Farbstoff vollständig auszuwaschen. Die anderen ließen sich ebenfalls trennen, indem er die Säule aufbrach, an den Phasengrenzen Segmente herausschnitt und jede Bande gleichfalls mit Lösungsmittel auswusch.

Tswett taufte sein Verfahren auf den Namen Chromatographie, genauer gesagt Adsorptionschromatographie, ein dem griechischen Wortschatz entlehnter Begriff, der übersetzt soviel heißt wie Farbenschreiben. Das Trennergebnis, das Bandenmuster, wird Chromatogramm genannt.

 
 

Zswetts Versuch im Detail: Ein Farbstoffgemisch wird in einer Lösung, einer mobilen Phase, durch eine Säule transportiert und an der Oberfläche eines Feststoffs, der stationären Phase, in einem dynamischen Gleichgewicht angelagert, also adsorbiert, wobei die verschiedenen Inhaltsstoffe unterschiedlich lange zurückgehalten werden: Locker gebundene Farbstoffe reißt der vorbeiströmende Lösemittelfluss eher mit, während ihm die mit dem Feststoff stärker wechselwirkende Farbstoffe länger standhalten; sie gelangen später ans Säulenende. Folglich beruht die Trennung der Blattfarbstoffe auf unterschiedlichen Adsorptions- beziehungsweise Anlagerungskräften zwischen der stationären Phase (Feststoff) und den Farbstoffen (Komponenten).

Nachdem Zswett seine Beobachtung als adsorptiven Prozess zu bestimmen wusste, fehlte ihm noch eine exakte Bezeichnung für den Trennmechanismus. Schließlich taufte der Botaniker sein Verfahren auf den Namen Chromatographie, ein dem griechischen Wortschatz entlehnter Begriff, der übersetzt soviel heißt wie Farbenschreiben beziehungsweise, da die Trennung auf der Adsorption an einem Feststoff beruht, Adsorptionschromatographie. In Anlehnung daran wird die Darstellung des Trennergebnisses, das in Banden aufgetrennten Farbstoffgemisch, als Chromatogramm bezeichnet.

 
 

Zugeschaut und nachgebaut: Chromatographieren kann jeder

Nicht jeder muss ein Chemiker sein, um das Zswettsche Farbexperiment in ähnlicher Weise zu wiederholen. Dafür genügen bereits einige Hilfsmittel aus Kinderzimmer und Küche: Man verrühre verschiedenfarbige Tinten (Probe) und gebe einen kleinen Klecks dieser Mischung auf ein Filterpapier (stationäre Phase). Anschließend tropfe man etwas Wasser (mobile Phase) in das Zentrum dieses Punktes und sehe zu, was passiert: Der Farbklecks dehnt sich mit der Wasserfront kreisförmig aus, wobei er sich in die einzelnen Komponenten auftrennt und farbige, kreisförmige Banden bildet - das Chromatogramm der verwendeten Tinten.

Dieses Phänomen hat nichts mit Zauberei zu tun, sondern lässt sich physikalisch mit den so genannten Kapillarkräften erklären. Sie bewirken zum Beispiel, dass Wasser von der Wurzel eines Baumes bis hinauf in seine Krone steigt, dass ein Blutstropfen, nach einem vom Arzt verabfolgten Pieks in die Fingerbeere, aus eigener Kraft ein winziges Röhrchen anfüllt oder dass Wasser von einem Schwamm aufgesogen wird. Immer ist die Flüssigkeit einem permanenten Sog unterworfen, der in haarfeinen Gefäßen, sogenannten Haargefäßen, herrscht.

Auch Poren von Filterpapieren haben eine kapillarähnliche Faserstruktur, was ihre Sogwirkung auf Flüssigkeiten erklärt. Warum aber werden verschiedene Farbstoffe unterschiedlich schnell aufgesogen? Da die Struktur des Filterpapiers unverändert bleibt, kann die Antwort nur sein: Sie hängt unmittelbar von der Beschaffenheit und/oder den Inhaltsstoffen einer Flüssigkeit ab.

 
 

Friedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867)

Ein wichtiger Wegbereiter für die Chromatographie war der deutsche Chemiker Friedlieb Ferdinand Runge, der bereits Anfang des 19. Jahrhunderts Farbtrennversuche auf Löschpapier durchführte. In seiner Dissertation aus dem Jahre 1822 bezeichnete er das Phänomen erstmals als Kapillaranalyse. Allerdings schien Runge mehr an der Kunst als an der Wissenschaft interessiert gewesen zu sein, wie der Titel einer seiner Arbeiten aus dem Jahr 1850 belegt: "Zur Farbchemie. Musterbilder für Freunde des Schönen und zum Gebrauch für Maler".

 
 

Friedrich Schönbein (1799 - 1868)

Christian Friedrich Schönbein, Professor für Chemie an der Universität Basel und Entdecker des Ozons, verfolgte das Ziel, die Kapillaranalyse ihrem Namen entsprechend analytisch zu nutzen. Was ihm um das Jahr 1860 auch gelang, denn wenig beschrieb der Chemiker Friedrich Goppelsröder (1837 - 1919) in einem Aufsatz eines von Schönbeins Experimenten, bei dem er mittels der Kapillaranalyse eine Mischung aus Wasser, Lackmus und Säure erfolgreich aufzutrennen vermochte. "Der Schlüssel zu einer neuen analytischen Methode", resümierte Goppelsröder über die Kapillaranalyse. Als er einige Zeit später mit ihrer Hilfe Azulene aus Kamille und Eukalyptus isolierte, jubelten Naturforscher: Schon seit langem lag diese Form cyclischer Kohlenwasserstoffe im Fokus der chemischen und Arzneimittelforschung, da ihnen eine entzündungshemmende, antiallergische und regenerative Wirkung nachgesagt wurde, was heute erwiesen ist.

 
 

Friedrich Goppelsröder (1837 - 1919)

Goppelsröder hatte mit seinen Versuchen gezeigt, dass sich nicht nur Blattfarbstoffe, sondern auch andere Naturstoffe mit Hilfe der Kapillaranalyse, also der Kapillarwirkung des Löschpapiers, trennen ließen - sofern geeignete Parameter wie Beschaffenheit, Zusammensetzung oder pH-Wert der mobilen Phase (Lösungsmittel), gegeben waren. Leider erging es Runge, Schönbein und Goppelsröder nicht viel anders als dem russischen Botaniker Zswett: Ihre Leistungen und Erkenntnisse auf dem Gebiet der Kapillaranalyse, der ersten erfolgreich durchgeführten chromatographischen Trennung, fanden in der Wissenschaft kaum Beachtung. Erst Ende der dreißiger Jahre des 20. Jahrhunderts wurde die Chromatographie als effektives Instrument bei der Analyse komplexer Stoffgemische erkannt.

 
 

Richard Kuhn (1900 - 1967)

Den Stein ins Rollen brachte Richard Kuhn (1900 - 1967). Der Chemiker vom Max-Planck-Institut für medizinische Forschung in Heidelberg hatte sich vorgenommen, Farbstoffe aus der Reihe der Carotinoide zu trennen und unter anderem das Vitamin A und zahlreiche andere Vitamine zu isolieren und zu untersuchen.

 
 

Richard Willstätter (1872 - 1942)

Wie es der Zufall wollte, war Kuhn ein Schüler von Richard Willstätter (1872 - 1942) gewesen, der im Jahre 1915 für seine Arbeit über die Pflanzenfarbstoffe, insbesondere das Chlorophyll, mit dem Nobelpreis geehrt wurde. Der Zswettschen Adsorptionschromatographie sei Dank, Willstäter hatte nämlich in der Dissertation des russischen Botanikers geblättert und dessen Erfindung erfolgreich abgekupfert. Warum also sollte es nicht auch Kuhn gelingen, die Chromatographie für seine analytischen Zwecke zu nutzen? Kuhn erhielt 1938 den Nobelpreis für seine Arbeit über Carotinoide und Vitamine, die er nur dank der Chromatographie bewerkstelligen konnte.

 
 

Den Geheimnissen des Lebens auf der Spur: Proteinanalytik

In den folgenden Jahren wuchs weltweit das wissenschaftliche Interesse an den Bausteinen des Lebens, den Eiweißen und Zuckern. Ihr Geheimnis zu entschlüsseln, sie zu analysieren und nachzubauen, war erklärtes Ziel zahlreicher Wissenschaftler. Zuvor aber musste man sich mit Hilfe analytischer Methoden ein Bild von Aufbau und Struktur dieser Substanzen machen. Herkömmliche Verfahren erwiesen sich allerdings als zu aufwendig, zeitraubend und zehrten derart viel Material auf, es ließ sich nur mit großen Probemengen arbeiten. Der Ruf nach einer Mikromethode wurde laut – die Zwjetsche Adsorptionschromatographie kam erneut zum Tragen und mit ihr die Kapillaranalyse.

 
 

Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) und Archer John Porter Martin (1910-2002)

Als deutsche Bomber 1940 ihre tödliche Fracht über England abwarfen, brüteten die Wissenschaftler Martin und Synge in ihrem Labor im englischen Leeds unter erschwerten Bedingungen über der Frage, wie die Sequenzen von Aminosäuren, den kleinsten Bausteinen der Eiweiße (Proteine), exakt und einfach zu bestimmen wären. Bislang hatten die Chemiker die Trennung kurzer Eiweißfragmente, so genannter Polipeptide, mit Hilfe der Gegenstromdestillation bewerkstelligt.

 
 

Bei der Gegenstromdestillation wird die zu analysierende Probe in eine Lösung von zwei begrenzt miteinander mischbaren Flüssigkeiten gegeben, zum Beispiel Wasser - Butanol, und in einem Kolben erhitzt. Nach einer Weile verteilen sich die gesuchten Inhaltsstoffe je nach Art und Beschaffenheit ungleichmäßig in den beiden Phasen, wobei ihre Konzentration in Butanol höher ist. Der Dampf steigt, vereinfacht dargestellt, durch eine Glasröhre, die an ihrem höchsten Punkt abknickt und in einen zweiten Kolben mündet. Da Wasser bekanntermaßen bei 100° Celsius, Alkohole wie Butanol im Gegensatz dazu schon eher (97,5°C) sieden, steigt zunächst mehr, mit Peptiden angereicherte Butanoldampf im Glasrohr auf und verflüssigt sich erst oberhalb der Kondensationsgrenze von Wasser wieder. Das Butanol sammelt sich im zweiten Kolben, während Wasser im Gegenstrom entlang der Glasrohrwand und dem aufsteigenden Butanol-Dampft zurück in den ersten Kolben fließt.

 
 

Der Clou der Stofftrennung mittels Gegenstromdestillation beruht auf der Löslichkeit, mit anderen Worten: der Verteilung eines Stoffes in zwei miteinander nur eingeschränkt mischbaren flüssigen Phasen, die zudem unterschiedliche Siedepunkte aufweisen müssen. Während sich die Peptide im Dampf des Niedrigsieders anreichern, nimmt ihre Konzentration im wässrigen Rückstand des ersten Kolbens ab. Kontinuierlich stellt sich ein Verteilungsgleichgewicht ein, sowohl zwischen den flüssigen Phasen als auch zwischen dem aufsteigendem Dampf und des herabfließenden Kondensats. Dabei steigt die Konzentration der gesuchten Komponenten in der aufsteigenden Dampfphase mit jedem Zentimeter Höhe, während ihr Gehalt im Wasser, im ersten Kolben also, stetig abnimmt, bis die Konzentration letztlich gegen Null geht.

 
 

Nobelpreis für die Erfindung der Verteilungschromatographie

Wie wäre es, kam es Martin und Synge in den Sinn, würde man statt zwei Phasen, Dampf und Kondensat, nur noch eine bewegen? Und war zudem eine Temperatursteigerung notwendig. Um diese Fragen zu beantworten, füllten die Forscher eine Glassäule mit porösem Kieselgel und tränkten es mit Wasser (stationäre Phase), welches die Funktion des Kondensats bei der Gegenstromdestillation übernehmen sollte. Auf das obere Ende des Säulenfüllmaterials gaben sie daraufhin die Probenlösung und entwickelten das Chromatogramm der Aminosäuren mit unterschiedlichen mobilen Phasen wie Butanol, Petroläther oder Chloroform. Anders als beim Zswettschen Farbversuch sah man keine bunten Banden. Die Flüssigkeit musste aufgefangen werden; die darin enthaltenen Peptide wurden dann mit Hilfe einer Farbumschlagsreaktion identifiziert.

Martin und Synge hatten die Verteilungschromatographie erfunden. Ob sie sich damals hätten träumen lassen, für eine solch scheinbare Banalität mit dem Nobelpreis für Chemie belohnt zu werden? Im Gegensatz zur Tswettschen Chromatographie beruhte ihre Trennmethode nicht auf der Adsorption, sondern auf der Verteilung der Komponenten in den einzelnen Fraktionen. Die Wissenschaftler verfeinerten ihre Erfindung, setzten statt Kieselgel auch mit Flüssigkeiten getränktes Papier in die Säule ein, erfanden so kurzerhand die Papierchromatographie, und schalteten sie in einen kontinuierlichen Lösemittelfluss.

Durch ein Septum spritzten sie die Probe vor die Säule: Die Inhaltsstoffe wurden mitgerissen, traten entsprechend ihrer molekularen Eigenschaften, also ihrer Löslichkeit, mit der stationären Phase in Wechselwirkung, wurden unterschiedlich stark verzögert, aufgetrennt und konnten so hinter der Säule Komponente für Komponente detektiert werden.

Anfangs erfolgte die Detektion noch mittels einer Farbumschlagsreaktion. Später maß man die elektrische Leitfähigkeit der bewegten Phase, konnte so Rückschlüsse auf die Inhaltsstoffe ziehen und deren Konzentration berechnen. Moderne Detektoren liefern heute Aussagen über Art und Menge der zu vermessenden Probenkomponenten, indem sie die Masse von Molekülbruchstücken oder den Energieinhalt der untersuchten Substanzen bestimmen oder die Aufnahme beziehungsweise Abstrahlung von Lichtern bestimmter Wellenlängen aufzeichnen. Dabei sind die Meßgeräte derart empfindlich, daß sich mit ihnen, bildlich gesprochen, sechs exakt bestimmte Personen gezielt aus der Weltbevölkerung von sechs Milliarden Menschen herausfinden ließen.

 
 

Chromatographie – unverändert gut

Auch wenn sich Messgenauigkeit und Empfindlichkeit der Detektoren bis heute um Potenzen verbessert haben, das Prinzip der chromatographischen Trennung ist unverändert geblieben. Einzig die verwendeten Säulen sind nicht mehr sperrige Gebilde aus Glas, sondern zum Teil haarfeine Fasern, durch die unter hohem Druck die mobile Phase fließt - entweder ein Gas oder eine Flüssigkeit, je nach Anwendungsgebiet. Der Nobelpreis, den Martin und Synge für die Erfindung der Verteilungschromatographie erhalten haben, ehrt, bei genauer Betrachtung posthum Zswett und alle Wissenschaftler, die dank ihrer Forschung die Chromatographie zu dem gemacht haben, was sie heute ist: Ein unverzichtbares Werkzeug in Medizin, Industrie, Pharmazie, Umwelt- und Lebensmittelanalytik.
Ob der russische Botaniker damals die Tragweite seiner Erfindung ermessen konnte? Zumindest versäumte er es, seinen Namen an sie zu knüpfen und sich so ein unumstößliches Denkmal zu setzen. Oder mußte er das gar nicht? Sein russischer Name, Zwjet, heißt ins Deutsche übersetzt Farbe.
GDeußing